A citricultura enfrenta grandes desafios fitossanitários, devido, principalmente, à ausência de cultivares de laranjas doces resistentes a bactérias causadoras de doenças, entre elas o cancro cítrico, causado pela bactéria Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc). Buscando criar soluções eficazes, pesquisadores do INCT Citros estão utilizando ferramentas biotecnológicas para desenvolver plantas transgênicas resistentes ao cancro cítrico.

Há pelo menos 65 anos, o cancro cítrico tem sido uma fonte constante de problemas para os citricultores paulistas

A bactéria X. citri foi identificada pela primeira vez no Estado de São Paulo em 1957, na região de Presidente Prudente, e desde então tem se disseminado pelo país, principalmente dentro de SP.

O cancro cítrico, dependendo do seu grau de severidade, causa desfolha, depreciação e queda prematura dos frutos. Como resultado, existe uma diminuição na produção e dificuldade de comercialização dos frutos. O controle e prevenção do cancro cítrico é realizado com a aplicação de produtos à base de cobre e, em casos mais graves, com a erradicação das plantas contaminadas.

Plantas Transgênicas: Uma Solução Inovadora para o Cancro Cítrico

A biotecnologia se destaca como uma ferramenta eficaz para acelerar o processo de criação de novas cultivares, e o desenvolvimento de plantas transgênicas resistentes ao cancro cítrico surgem como uma oportunidade promissora para introduzir novas cultivares de laranjas doces como soluções para o controle desta doença em um período mais curto.

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O que são plantas transgênicas?

O termo transgênico foi adotado para descrever organismos que receberam genes de outra espécie por meio da biotecnologia – técnicas moleculares utilizadas por pesquisadores para isolar, copiar e transferir sequências específicas de DNA.

Dessa forma, plantas transgênicas são aquelas que incorporam em seu genoma sequências de DNA (genes) de uma espécie não compatível sexualmente. Essa espécie pode ser uma planta, um microrganismo, um animal ou qualquer organismo vivo. Esse processo de modificação genética visa conferir às plantas características específicas, tais como resistência a doenças, como é o caso do cancro cítrico.

Essa abordagem inovadora apresenta a vantagem de acelerar o desenvolvimento de cultivares mais robustas e adaptadas, representando uma estratégia eficiente para enfrentar os desafios na citricultura.

Pesquisa do INCT Citros no desenvolvimento de plantas transgênicas resistentes ao Cancro cítrico

O grupo de pesquisa liderado pelo Dr. Francisco Mourão, pesquisador da equipe de pesquisa da plataforma de genômica funcional e melhoramento assistido do INCT Citros, conseguiu desenvolver, por meio da biotecnologia, plantas transgênicas de laranja doce cv. Hamlin (Citrus sinensis L. Osbeck). A pesquisa contou com a colaboração de pesquisadores do Instituto Biológico e da Embrapa. São dois “tipos” de abordagens:

• Plantas transgênicas com o gene d4e1
• Plantas transgênicas com o gene csd1

O gene d4e1 é um peptídeo sintético e apresenta atividades antimicrobianas já comprovadas e, o gene csd1, produz um superóxido dismutase de cobre e zincoque é uma enzima antioxidante com atividade comprovada para resistência a estresses bióticos e abióticos. Dr. Francisco Mourão – Universidade de São Paulo, ESALQ.

Desafiando as plantas transgênicas frente a bactéria causadora do cancro cítrico

Após a confirmação da presença dos genes d4e1 ou csd1 em plantas de laranja doce, os pesquisadores embarcaram em uma outra fase do estudo: a avaliação do funcionamento desses genes nas plantas e a verificação de sua eficácia em fortalecer a defesa contra a bactéria causadora do cancro cítrico.

Quando trabalhamos com transformação genética é comum termos mais de uma planta transgênica para cada gene. Por exemplo, em nosso trabalho conseguimos 13 plantas de laranja com o gene csd1, chamamos cada uma dessas plantas de “evento transgênico”. Realizamos diversos experimentos a fim de identificar o evento em que o gene “funciona melhor”. Explica Dr. Matheus Luís Docema, pesquisador que estudou, em sua tese de doutorado, a resposta dessas plantas transgênicas à infecção por essa doença.

A validação do papel desses genes na resistência à bactéria é essencial para garantir o sucesso da abordagem transgênica no desenvolvimento de cultivares mais robustas e resilientes.

Para selecionar o melhor evento, é preciso colocar a planta para “brigar” com a bactéria. Uma das formas de se conseguir isso é:

Primeiramente a bactéria é crescida em um meio de cultura, em seguida, é diluída em uma solução de inóculo para uma concentração conhecida. Dessa forma, os pesquisadores conseguem inocular sempre a mesma concentração de bactérias em diferentes plantas.

A pesquisa realizada levou em consideração duas estratégias de inoculação:

• “Spray”, na qual a solução de inóculo é pulverizada na superfície das folhas de laranjeiras
• “Ferida”, na qual a “micro agulhas” são imersas na solução de inóculo e então utilizadas para fazer micro furos na superfície das folhas.

Para chegar em resultados confiáveis e replicáveis, os pesquisadores trabalharam com 12 repetições, sendo cada repetição representada por uma única planta, tanto para os eventos transgênicos quanto para os grupos de controle (plantas não transgênicas). Esse arranjo experimental foi repetido três vezes.

Com isso, foi realizado um estudo comparativo e bastante aprofundado entre plantas transgênicas e plantas não transgênicas. Os pesquisadores conseguiram então, avaliar a presença e ausência de bactérias e sintomas nas plantas, assim como a intensidade nas respostas moleculares de defesa das plantas.

A presença dos genes d4e1 ou csd1 faz com que plantas de laranja doce resistam ao cancro cítrico

Em geral, os pesquisadores confirmaram que a incidência e severidade do cancro cítrico em plantas transgênicas de laranja foram reduzidas. Tanto em eventos com o gene d4e1 como em eventos com o gene csd1, quando comparadas às plantas não transgênicas.

Nessas plantas, a bactéria proliferou com menos severidade, resultando em baixas progressões da doença nas laranjeiras transgênicas. As análises anatômicas e o atraso nos sintomas visuais em alguns eventos transgênicos sugerem uma diminuição considerável na gravidade da doença.

Nós também identificamos que a resistência encontrada em plantas de laranja com o gene csd1 é devido a uma maior atividade de enzimas antioxidantes. Além disso, encontramos maior deposição de calose, aumento no tamanho das células (hipertrofia) e aumento no número de células (hiperplasia), especialmente, nas proximidades dos estômatos. Respostas que desempenham um papel crucial na defesa contra patógenos. Dr. Matheus Luís Docema – Universidade de São Paulo, ESALQ.

Com essa publicação científica, o projeto INCT Citros, liderado pela equipe do Dr. Francisco Mourão, apresenta duas novas abordagens para o controle do cancro cítrico em laranjas doces. Os resultados dessa pesquisa abrem portas para o desenvolvimento potencial de cultivares de laranjeiras mais resistentes ao cancro cítrico, contribuindo significativamente para a sustentabilidade da produção citrícola.

No entanto, é importante ressaltar que mais estudos, incluindo testes de campo, são necessários para validar plenamente a eficácia dessas estratégias inovadoras. O trabalho desses pesquisadores representa um passo promissor rumo a um futuro mais resiliente para as plantações de citros em todo o mundo.

Referências

Docema, M. L., et at. Transgenic ‘Hamlin’ sweet orange expressing csd1 or d4e1 genes exhibits decreased susceptibility to citrus canker disease, 2022.

Defesa Agropecuária de São Paulo. Presença do Cancro Cítrico em São Paulo completa 65 anos. Disponível em: https://www.defesa.agricultura.sp.gov.br/informativo/defesa-agrosp-no-016-novembro20/presenca-do-cancro-citrico-em-sao-paulo-completa-65-anos/#:~:text=O%20cancro%20c%C3%ADtrico%20surgiu%20no,no%20Estado%20de%20S%C3%A3o%20Paulo. Acesso em: 15/11/2023.

Conteúdo desenvolvido por: Descascando a Ciência

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A pesquisa liderada pelo grupo da Dra. Alessandra Alves de Souza, pesquisadora do Centro de Citricultura Sylvio Moreira, e com participação do Dr. Reinaldo Rodrigues de Souza Neto, financiamento do Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia (INCT), traz inovação ao transformar um mecanismo de defesa bacteriana em uma tecnologia na agricultura. O trabalho envolve a criação de plantas transgênicas de laranja doce que escondem uma toxina bacteriana em seu genoma, proporcionando uma abordagem alternativa à utilização de agrotóxicos tradicionais.

Fica com a gente e vamos juntos entender como a pesquisa básica pode fornecer ferramentas para desenvolvimento de novas tecnologias.

Bactérias produzem toxinas contra suas próprias células

Existe um mecanismo genético em bactérias chamado sistema toxina-antitoxina (TA). O interesse dos pesquisadores nesse mecanismo é porque ele está envolvido em importantes processos celulares como por exemplo: crescimento, morte e até mesmo resistência a antibióticos.

São muitos os sistemas TA encontrados em bactérias, e cada um deles possui características específicas que contribuem para a adaptação e sobrevivência desses microrganismos em diferentes ambientes.

Nos chamou a atenção o fato de duas bactérias causadoras de doenças em citros terem um genoma muito semelhantes, mas possuírem sistemas TA diferentes. Enquanto Xylella fastidiosa possui o sistema TA mqsRA, Xanthomonas citri não o possui. Dra. Alessandra Alves de Souza – Centro de Citricultura Sylvio Moreira (IAC).

O sistema mencionado pela Dra. Alessandra é composto por duas proteínas, a MqsR que, quando presente em concentrações elevadas, é tóxica para a bactéria e a MqsA que neutraliza a atividade tóxica. Quando a MqsA está presente em quantidades adequadas, a MqsR é mantida sob controle e não afeta negativamente a bactéria.

Você pode estar se perguntando: por que a bactéria produz algo que é tóxico para ela?

Quando a bactéria está vivendo em condições normais a antitoxina MqsA é produzida e mantém a toxina MqsR sob controle.

No entanto, quando a bactéria se sente ameaçada, como quando é exposta a um antibiótico ou bactericida, ela diminui a produção de MqsA. Isso faz com que a toxina MqsR comece a agir, inibindo alguns processos celulares. Isso pode parecer estranho, mas, na verdade, é uma estratégia de sobrevivência inteligente da bactéria.

A paralisação temporária do crescimento bacteriano permite que a bactéria sobreviva até que as condições do ambiente se tornem favoráveis novamente. É como se a bactéria entrasse em um modo de hibernação até que o perigo tenha passado.

Esse comportamento é chamado de “persistência”. Pesquisas do nosso grupo já demonstraram que o sistema TA mqsRA está envolvido no processo de tolerância da bactéria X. fastidiosa contra bactericidas a base de cobre – muito utilizado na citricultura. Dr. Reinaldo R. de Souza Neto – Centro de Citricultura Sylvio Moreira (IAC).

Compreendendo esse mecanismo os cientistas viram uma oportunidade: utilizar a toxina MqsR como um inibidor de crescimento contra X. citri e possivelmente outras bactérias que não possuíssem a antitoxina.

Num primeiro momento precisávamos confirmar nossa hipótese de que a toxina MqsR teria o efeito esperado no controle de X. citri. Para isso, avaliamos em laboratório o efeito da toxina pura contra a bactéria. Os resultados mostraram que mesmo concentrações baixas da proteína eram eficientes em reduzir o crescimento da bactéria e isso acontecia em poucas horas. Dra. Alessandra Alves de Souza – Centro de Citricultura Sylvio Moreira (IAC).

Diversos experimentos foram conduzidos para validar o funcionamento da toxina e antitoxina nas bactérias. Com um conhecimento completo desse mecanismo, os pesquisadores avançaram para o desenvolvimento da nova tecnologia.

Ataque de cavalo de troia: uma nova tecnologia na agricultura

Certamente você já ouviu a expressão cavalo de troia, frequentemente usada para se referir a algo que parece benéfico por fora, mas, que na realidade esconde algo. A tecnologia agrícola desenvolvida pelo grupo de pesquisa da Dra. Alessandra tem suas semelhanças com um cavalo de troia.

Os pesquisadores conseguiram criar uma planta transgênica de laranja doce (Citrus sinensis) que contém, em seu genoma, a sequência genética (gene) responsável pela produção da toxina MqsR.

Em termos simples, esta planta transgênica é praticamente idêntica a qualquer outra laranja doce, exceto por um pequeno fragmento de DNA que faz com que ela produza a toxina naturalmente.

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O que é notável é que a bactéria X. citri pode infectar essa planta transgênica, mas não consegue se desenvolver nela, evitando assim a ocorrência da doença.

Essa abordagem, que utiliza o sistema TA em plantas transgênicas, representa uma estratégia inovadora e uma alternativa ao desenvolvimento de agrotóxicos tradicionais. Podemos considerar a tecnologia apresentada neste artigo como um protótipo do que poderia se tornar uma nova geração de plantas transgênicas. Dr. Reinaldo R. de Souza Neto – Centro de Citricultura Sylvio Moreira (IAC).

Referência

Souza-Neto, R. R. et al.MqsR toxin as a biotechnological tool for plant pathogen bacterial control. Nature Scientific Reports, 2022.

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Você já parou para pensar como as plantas conseguem sobreviver em meio a tantos desafios do campo e da natureza? Elas não podem fugir ou se esconder, mas têm mecanismos de defesa incríveis para se protegerem de microrganismos, insetos, excesso de Sol, frio e outros “estresses”.

Para os cientistas agrícolas isso não é novidade. No entanto, pesquisadores brasileiros conseguiram descobrir, em plantas de laranja, novos mecanismos de defesa. O que é muito importante para o desenvolvimento de novas tecnologias agrícolas destinadas aos produtores rurais. Esse é um dos projetos vinculado ao programa Institutos Nacionais de Ciência e Tecnologia e Inovação -INCTs.

Descobertas como essa também são importantes para consumidores conscientes. É a partir dela que conseguimos produzir alimentos utilizando menos recursos financeiros e ambientais. Para entender isso melhor, fique com a gente.

Doenças reduzem a produção de alimentos

Como você pode ver nessa reportagem: Estimativa para safra (2023/2024) da laranja aponta queda de 1,5% na produção,  doenças e fatores climáticos são alguns dos principais fatores que podem diminuir a produção de laranjas.

Nesse sentido, para evitar grandes perdas, cientistas buscam por novas estratégias para proteção das plantas. Esse é o caso do grupo de pesquisa dos pesquisadores Dr. Henrique Ferreira e Dr. Leonardo Saldanha (UNESP/Rio Claro).

O desafio das doenças bacterianas

O cancro cítrico é uma das problemáticas da citricultura – doença caracterizada pelo aparecimento de lesões em frutos, folhas e ramos de plantas de citros. Essa doença é causada pela bactéria Xanthomonas citri subsp. citri (X. citri), não existe cura e faz com que a produção de laranjas seja menor.

Para solucionar esse problema, os pesquisadores optaram por investigar quais vias metabólicas eram “ativadas” e quais metabólitos eram produzidos pela planta quando infectada pela bactéria.

Um pouquinho de como aconteceu a pesquisa

O principal experimento acontecia da seguinte forma: folhas de plantas sadias de laranja doce (Citrus sinensis L. Osb.) eram infectadas com X. citri ou água. Dessa forma, era possível comparar as duas situações e ver quais eram as substâncias químicas exclusivas produzidas pela planta infectada pela bactéria.

Essas diferenças eram avaliadas em diferentes tempos, 0h, 6h, 12h, 24h e 48h após a infecção. Com isso, foi possível identificar diferentes mecanismos de defesa da planta contra a bactéria.

“Na busca pela resposta à infecção, enfrentamos a dificuldade de lidar com um grande número de amostras, mas superamos esse desafio ao utilizar equipamentos precisos e técnicas computacionais avançadas.”  Dr. Henrique Ferreira – Pesquisador UNESP/Rio Claro

Para chegar a um resultado os experimentos eram repetidos muitas vezes, ou seja, centenas de folhas foram infectadas com a bactéria, outras centenas de folhas foram infectadas com água e assim os pesquisadores conseguiram identificar um padrão de resposta e aumentar a confiabilidade do que estava sendo visto.

“A pesquisa demandou cerca de 2 anos para ser concluída, com uma importante colaboração de pesquisadores estrangeiros. Além dos experimentos feitos aqui, foram 7 meses dedicados à realização de experimentos no exterior.” Dr. Leonardo Saldanha – UNESP/Rio Claro

Mecanismo de defesa e substâncias químicas protetoras

Técnicas específicas e equipamentos ultrassensíveis foram utilizados para identificar as substâncias químicas que eram produzidas pela planta, quando infectada por X. citri. Com isso, os pesquisadores identificaram ácidos graxos já conhecidos por atuar na defesa contra patógenos e novos metabólitos que nunca haviam sido associados a um papel de defesa contra microrganismos patogênicos. Substâncias químicas derivadas de triptamina fazem parte dessa descoberta.

“A utilização de triptaminas e outros compostos como princípio ativo em agrodefensivos foliares pode ser uma promissora alternativa, visando proteger as plantas de doenças.” Dr. Leonardo Saldanha – Pesquisador UNESP/Rio Claro

A pesquisa desenvolvida pelo grupo do Dr. Henrique Ferreira foi a primeira a descrever propriedades antimicrobianas de moléculas derivadas de triptamina e associá-las ao mecanismo de defesa de plantas.

Com isso, surgem diversas possibilidades com o melhoramento genético de citros visando maior expressão de genes relacionados a produção de triptamina; o uso dessa molécula e seus derivados na formulação de novos agrotóxicos. Além disso, deve ser avaliado o potencial dessa substância química em combater outras doenças.

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Mecanismo de defesa e o poder da ciência básica

Esse trabalho também deixa claro o poder da ciência básica – um tipo de pesquisa que busca expandir o conhecimento sobre os princípios fundamentais da natureza, sem focar diretamente em aplicações práticas imediatas. É um tipo de pesquisa voltado para a compreensão do que já acontece na natureza e para aprofundar o conhecimento científico em si.

Já é sabido que plantas se defendem contra microrganismos, mas o trabalho realizado pelos cientistas brasileiros trouxe avanços significativos no entendimento dos mecanismos de defesa das plantas de laranja contra a bactéria X. citri.

Não será de imediato, mas essa descoberta irá beneficiar os produtores rurais, permitindo o desenvolvimento de novas tecnologias agrícolas, e toda a sociedade, ao possibilitar a produção de alimentos de forma mais eficiente e sustentável.

“A partir desses resultados, é possível considerar o aprimoramento genético de variedades de citros, visando reduzir a suscetibilidade ao cancro cítrico e melhorar a resistência das plantas.” Dr. Henrique Ferreira – Pesquisador UNESP/Rio Claro.

Compreender como as plantas combatem doenças é fundamental para garantir a segurança alimentar e a sustentabilidade no setor agrícola. O trabalho do grupo de pesquisa do Dr. Henrique Ferreira representa um importante passo nesse sentido, abrindo portas para futuras pesquisas e inovações na proteção das plantas e na produção de alimentos.

Referência

Saldanha, L. L., et al. Metabolomic- and Molecular Networking-Based Exploration of the Chemical Responses Induced in Citrus sinensis Leaves Inoculated with Xanthomonas citri. J. Agric. Food Chem. 2022. Disponível em: https://doi.org/10.1021/acs.jafc.2c05156.

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